Intereses. A principios de la década de 1560, el fracaso de Pánfilo de Narváez y Hernando de Soto para descubrir riquezas fácilmente extraíbles y la hostilidad de poderosas tribus indígenas como los Calusa se combinaron para disminuir el interés español en la parte sureste de América del Norte. La Florida, sin embargo, siguió atrayendo la atención de España y otros estados europeos debido a su posición estratégica justo al norte del curso que la flota del tesoro española anual realizaba en su viaje de regreso cargado de riquezas a Sevilla. Después de la Paz de Cateau-Cambrésis en 1559, la corona francesa en particular miró a Florida como un lugar ideal desde el cual los corsarios podrían atacar la flota del tesoro y saquear los asentamientos españoles del Nuevo Mundo. En consecuencia, Francia hizo planes para establecer un fuerte en la costa atlántica de la península. Para la corona española, por otro lado, Florida sirvió como un baluarte crítico que protegía sus posesiones caribeñas de los asaltantes. En consecuencia, gran parte de los esfuerzos de España para defender su imperio del Nuevo Mundo se centró en asegurar que un rival europeo como Francia nunca tomara posesión de la península.
Fuerte Caroline. Tras el fracaso de la expedición Tristán de Luna y Arellano en 1562, el rey Felipe II de España llegó a la conclusión de que los indios Timucua y Calusa eran lo suficientemente poderosos y hostiles como para mantener a los competidores europeos de España fuera de Florida. Ese mismo año, sin embargo, el almirante francés Gaspard de Coligny, un hugonote o protestante francés, envió una expedición para establecer una colonia de corta duración en el sitio de la actual Port Royal, Carolina del Sur. Aunque ese acuerdo fracasó, Coligny decidió enviar una segunda fuerza de doscientos soldados y colonos bajo el mando de René Goulaine de Laudonnière a Florida con órdenes de establecer una base permanente. Al llegar en junio de 1564, el grupo de De Laudonnière construyó Fort Caroline cerca de la desembocadura del río St. John en la costa atlántica de Florida. El conflicto llegó rápidamente para ellos; no mucho después de que construyeron su asentamiento, se vieron envueltos en las guerras intertribales de los indios Timucua locales. Más importante aún, los hombres de De Laudonnière pronto asaltaron asentamientos españoles y barcos en el Caribe.
Respuesta española. Las noticias del asentamiento francés pronto persuadieron a Philip de revertir su reciente decreto contra la colonización de Florida. En consecuencia, ordenó a Pedro Menéndez de Avilés, ex comandante de las flotas de Indias, que dirigiera una expedición a Florida, pusiera fin a la amenaza francesa y estableciera un asentamiento español permanente que pudiera controlar la península. La poderosa fuerza de Menéndez de ochocientos hombres llegó a Florida en agosto de 1565 solo para descubrir que un escuadrón francés que transportaba quinientos refuerzos los había adelantado hasta Fort Caroline. Consciente de que la infantería hugonote recién llegada hacía imposible un asalto anfibio al fuerte, Menéndez decidió navegar sesenta kilómetros hacia el sur y establecer una base antes de emprender un ataque por tierra contra el bastión francés. Poco después de que los españoles llegaran a tierra y establecieran su campamento, los indios Timucua hostiles a los franceses informaron a Menéndez que el comandante naval francés, Jean Ribault, estaba despojando a Fort Caroline de la mayoría de sus defensores para lanzar un asalto anfibio sorpresa contra los españoles. Aprovechando esta información y una fuerte tormenta que dispersó y destrozó la flota de Ribault, Menéndez marchó con sus tropas por tierra y asaltó Fort Caroline en un exitoso ataque al amanecer. De acuerdo con la naturaleza salvaje e implacable de la guerra de la Reforma, posteriormente acusó de herejía a más de cien de los hugonotes que se habían rendido recientemente y los hizo ejecutar en el acto. La mayoría de los supervivientes de la flota de Ribault, incluido su comandante, sufrieron un destino similar. Con la ayuda de la naturaleza y los indios Timucua, por tanto, España había terminado con la amenaza francesa a Florida.
Consecuencias. La lucha entre Francia y España por el control de Florida tuvo importantes consecuencias tanto para la colonización del sureste como para la guerra europea en el Nuevo Mundo. La victoria española puso fin a una seria amenaza para las futuras flotas del tesoro y limitó enormemente la capacidad de Francia para inmiscuirse en los territorios caribeños de España. La capacidad de España y Francia para permanecer en paz en Europa mientras sus fuerzas luchaban en el Nuevo Mundo, mientras tanto, reforzó las disposiciones implícitas en el Tratado de Cateau-Cambrésis de que la guerra "más allá de la Línea" no afectó las relaciones en el Viejo Mundo y que "el poder hace el bien" en las Américas. Más importante aún, el conflicto llevó a España a concluir que podía asegurarse contra otra potencia europea que estableciera una base en Florida solo manteniendo un asentamiento permanente en la península. San Agustín, la base que Menéndez había establecido para su ataque terrestre a Fort Caroline, se convirtió así en el primer asentamiento europeo permanente en América del Norte.